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蛋白質(zhì)的雙向電泳的向?yàn)榈入娋劢梗↖soelectrofocusing, IEF）,根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離；第二向?yàn)镾DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），按亞基分子量大小進(jìn)行分離。經(jīng)過電荷和分子量兩次分離后，可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量信息。

注意事項(xiàng)：

1. 一向聚焦與二向電泳之間需要平衡，時間視蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定，一般為10min，多不*過15min。

2. 過量的上樣量會引起雙向圖形畸形，特別在一向聚焦時，當(dāng)樣品濃度*過5mg時，則蛋白質(zhì)凝聚和沉淀，使二向時產(chǎn)生水平和垂直條紋。

3. 含尿素的試劑均應(yīng)避免過高的溫度處理，一般不要*過30℃，否則尿素分解產(chǎn)生異硫氰酸鹽會引起羧基甲酰化而導(dǎo)致電荷不均一性。

4. 向中過量的去污劑會嚴(yán)重影響雙向電泳圖譜，因此聚焦完畢進(jìn)行平衡前，用雙蒸餾水沖洗膠條，以除去殘留的去污劑。

5. 雙向電泳中雙向凝膠間的界面緊密接觸非常重要，如果接觸不好或者兩者之間留有氣泡，則導(dǎo)致轉(zhuǎn)移時分子擴(kuò)散。

6. 雙向電泳中的條紋現(xiàn)象是常見的問題。水平條紋可能與一向電泳時間不夠，聚焦不好有關(guān)，或者在加樣處產(chǎn)生沉淀和引起重新溶解所致；縱向條紋則表明樣品沒*溶解，這可以通過調(diào)整樣品量，增加電泳時間，改善樣品的溶解狀態(tài)，同時在加樣前通過高速離心以除掉所有不溶物。