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提問：降落PCR（Touchdown PCR）的原理？  

回答：Touchdown PCR是指每隔一個循環(huán)降低1°C反應退火溫度，直至達到“Touchdown"退火溫度，然后以此退火溫度進行10個左右的循環(huán)。該方法最初出現(xiàn)是為了避開確定最佳退火溫度而進行的復雜的反應優(yōu)化過程。正確和非正確退火溫度之間的任何差異將造成每個循環(huán)PCR產(chǎn)物量的兩倍差異（每攝氏度造成4倍差異）。因此相對于非正確產(chǎn)物，正確的產(chǎn)物可以得到富集該方法的另一個應用是在確定已知序列肽的DNA序列。

具體過程如下：使用兩套與已知序列肽兩末端可能配對的簡并引物，這只需要知道一段長為13個氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各長18個堿基（6個氨基酸），兩者之間有一個堿基以上的間隔。使用簡并引物即可以進行“Touchdown PCR"。由這種方法將獲得大量的產(chǎn)物，但因為由肽序列可以知道引物之間的確切距離，所以可以根據(jù)產(chǎn)物的大小來選擇所需要的產(chǎn)物。該方法的優(yōu)點在于可以富集引物與模板正確配對的產(chǎn)物。如果克隆和測需一打PCR產(chǎn)物，將可以確定肽的正確編碼序列，設計進行雜交的寡核苷酸等。該技術(shù)特別適用于由Ser，Lys和Arg（每個有6個密碼子）構(gòu)成的多肽。

 提問：降落PCR的優(yōu)點？

回答：綜合比較普通PCR技術(shù)和最大耐受量聚合酶鏈反應，認為前者程序簡單，省時，一般的PCR擴增儀都可完成，但缺點是退火溫度不適當時容易出現(xiàn)假陽性;而最大耐受量聚合酶鏈反應雖然程序復雜，需要擴增儀有較大的內(nèi)存，但能非常有效地降低或避免假陽性，且不在理想的工作條件（比如最佳鎂離子濃度）下也可擴增出產(chǎn)物。 

這就是降落PCR技術(shù)的優(yōu)點吧。不過我認為。如果能用普通PCR技術(shù)擴出來的話，盡量用普通的聚合酶鏈反應，雖然降落聚合酶鏈反應比較省事省力，但是，它在一個很寬的退火溫度里擴增，亂七八糟的條帶肯定比較多哈。雖然，電泳可能看不到。

降落PCR的一個優(yōu)點是可以增加某些基因的特異性,不僅我自己在擴基因的艱難歷程中,發(fā)現(xiàn)了這一優(yōu)點,而且也推薦給周圍的人,如果常規(guī)PCR循環(huán)程序的基因擴增效果不佳,我就來熱啟動加降落PCR.在非特異性背景較高的情況下,這招的確有效,但不絕對。

（參考文獻：一種優(yōu)化的PCR方法 降落PCR擴增目的基因
江蘇臨床醫(yī)學雜志 2002年02期
目的 :嘗試用一種新的PCR方法———降落PCR擴增目的基因。方法 :在構(gòu)建人CD137-hIgG1Fc - pCDNA3融合蛋白真核表達載體以及在檢測HBV多聚酶YMDD變異的過程中運用降落PCR擴增目的基因。結(jié)果 :擴增出的特異性條帶與目的基因大小一致。結(jié)論 :降落PCR省卻了常規(guī)PCR中摸索最適退火溫度的過程 ,對一些Tm值相近的PCR反應可應用一套溫度程序擴增 ,是一種行之有效的PCR方法。
下載附件：）

提問：溫度梯度PCR功能與降落PCR功能的區(qū)別？如：溫度梯度PCR,如25個循環(huán)的退火溫度為50℃~60℃，40秒；和降落PCR有什么不同之處，退火溫度從60℃~50℃，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低1℃；效果是不是都是一樣？

回答：溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時，為了找到優(yōu)退火溫度，在一臺PCR儀上同時做多管PCR，每一管放在儀器內(nèi)不同列（有的是不同行）上，分別進行PCR（如50℃~60℃可以分6管，分別為50，52，54，56，58，60度），最后看看哪個溫度的效果好。總之是用來進行退火溫度優(yōu)化的。

降落PCR是在同一個PCR管內(nèi)進行PCR，只是每個循環(huán)的溫度不同（如每個循環(huán)降1度）。一般兼并引物用這種方法多些。

提問：我的兩條引物說明書的Tm值分別為69℃、62℃，若用降落PCR如何設定溫度范圍？回答：這兩個TM值相差有點大,一般不要超過三度,我認為你的退火溫度就在62,63度左右,你可以先試試,如果你想做降落PCR,那么你可以先用高的退火溫度做幾個循環(huán),然后在換到較低退火溫度做幾個循環(huán),然后再用更低的溫度做剩下的循環(huán),對于你這個,你可以先用65度左右做5個循環(huán),然后在60度左右做5個循環(huán),其余在58度做剩下的循環(huán),只是經(jīng)驗,不一定能出來.

提問：什么情況下需要做降落PCR？

回答：主要是在出現(xiàn)非特異條帶時可以考慮用降落PCR,在高的退火溫度下做幾個循環(huán),這樣擴出的產(chǎn)物特異性好,可以做為后續(xù)反應的模板,然后再溫度較低的情況下以前面擴出來的較特異的產(chǎn)物做模板,這樣不但特異性好,而且產(chǎn)物也夠多,可以出現(xiàn)很好的結(jié)果。

還有就是在剛合成引物還未經(jīng)鑒定效果的時候,可以用降落PCR ,但是正如上面說的你的兩個引物的TM值相差的有點大,一般降落是在TM值以下3-5度開始將,每個循環(huán)降0.5或1度,降差不多十個循環(huán)后,再維持在最后一個循環(huán)的溫度上,不要擔心最后的循環(huán)數(shù)目不夠,其實只要模板量沒問題,二十個循環(huán)足夠了。

提問：剛合成的引物用降落PCR的原因是什么啊？

回答：因為理論計算的TM值用來確定退火的溫度只是一個參考呀,最合適的退火溫度會因為各種原因而有所差異,就連PCR儀都會有影響的,我們實驗室就是,好多都是在一臺能拉出條帶,而在另一臺上就拉不出條帶,或者相反的。

降落（TD）PCR代表了一種不同的PCR優(yōu)化方法。由于開始時的退火溫度選擇高于估計的Tm值，隨著循環(huán)的進行，退貨溫度逐漸降到Tm值，并最終低于這個水平。此策略有利于確保第一個引物－模板雜交事件發(fā)生在最互補的反應物之間，即那些產(chǎn)生目的擴增產(chǎn)物的反應物之間。盡管退火溫度最終會降到非特異性雜交的Tm值，但此時目的擴增產(chǎn)物已開始幾何擴增，在剩下的循環(huán)中處于滯后（非特異性）PCR產(chǎn)物的地位。有人研究發(fā)現(xiàn)一些本來產(chǎn)生滿意的單一擴增產(chǎn)物的反應采用TD PCR時變得更好進行了。

提醒一下，如果說明書上的Tm值和Oligo或者Primer上分析的差別挺大的，你要以軟件上的計算為準。 我覺的你兩個引物Tm值差的太多，不過你也可試。68度開始，每個循環(huán)下降0.5度，或者0.2度，最后62度來個20循環(huán)。